生物素磁珠

1. DNA pull down 實驗

原理：

DNA pull down 是一種研究DNA與蛋白互作的方法。其原理是：生物素標記的DNA 片段結合在鏈霉親和素磁珠上，再與核蛋白孵育，從而捕獲並純化出與DNA 片段互作的蛋白。捕獲的蛋白一方面可以通過Western blot驗證某一特定蛋白是否與靶DNA 片段結合；另一方面也可以進行質譜鑒定，篩選出與DNA片段可能互作的蛋白質。

操作步驟：

1.探針制備：

a.對於研究的啟動子靶標區域比較明確，且長度較短的DNA片段，可以直接合成並標記上生物素作為pull down探針。

b.對於研究的啟動子靶標區域沒具體預測區域，一般針對基因上游2000bp序列設計引物，並標記上生物素；然後通過判敏 PCR 擴增的方式釣取基因上游2000bp序列，回收純化後作為DNA pull down的探針。

2.樣本前處理

a. 用 1ml Cell lysis buffer重懸（10^7細胞）;冰上孵育10min，（5000g，4°，5min）離心，棄上清。

b. 加入2/3細胞體積的 Buffer B 懸浮細胞，超聲5s裂解細胞。4℃，10,400× g for 5 min離心5min；取上清。

c. 用Buffer D稀釋步驟b的上清液，-80℃凍存備用

3.Dynabead™ MyOne™ 鏈霉源沖運素親和素 C1預處理：

a. 渦旋震盪磁珠40s，混勻磁珠

b. 分裝60ul磁珠的1.5mL離心管中；

c. 磁力架上放置1min，棄上清；

d. 用1mL1X B&W Buffer洗滌磁珠3遍;

e. 用60ul 2X  B&W Buffer懸浮磁珠；

f. 加入60 pmol生物素標記DNA（1ug）;室溫顛倒孵育 15  min;

g. 磁力架雹樑上放置3min,去上清

h. 用60 μL 1X B&W Buffer洗滌3遍；

i. 用60ul 1× B/W buffer（ without NaCl）洗滌一遍

 4.DNA pull down

 a.制備binding reaction：加入100 µL 5× EMSA buffer 及包含100 µg 核蛋白   的上清液 ；補水至 500 µL.

 b. 加500ul binding reaction到磁珠中；常溫翻轉20min

 c.磁力架上放置1min，棄上清；

 d.用wash buffer 洗滌3遍。

e.回收產物，進行後續WB驗證或質譜鑒定。

PS:下邊是如期生物DNA pull 項目手冊，歡迎各位老師合作交流哈

2. 鏈霉親和素磁珠飽和生物素濃度是多少

鏈霉親和素磁復珠飽和生物制素濃度是多少
鏈霉親和素分子由4條相同的肽鏈組成，其氨基酸組成中，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，而且結合生物素的活性基團也是肽鏈中的色氨酸殘基；鏈霉親和素是一種稍偏酸性（pH6.0）的蛋白質，並且不帶任何糖基。在蛋白水解酶作用下，鏈霉親和素可在N端10～12和C端19-21間斷裂，形成的核心鏈霉親和素仍然保持完整的結合生物素的能力。鏈霉親和素的活性單位也是以結合1μg生物素所需的量來表示，1mg鏈霉親和素的最高活性可達18U。

3. 國內做鏈霉親和素磁珠的哪個廠家的用起來效果好啊求推薦~~~~

鏈霉親和素磁珠，主要用於IVD工業磁分離全自動化學發光免疫分析及生物醫葯基礎研究中分離生物素修飾成分的復合物。鏈霉親和素磁珠用於IVD的磁分離全自動化學發光免疫分析，其懸浮穩定性、磁響應速度、非特異吸附及信噪比、結構/性能的儲存穩定性是定性指標，只有這些定性指標同時都滿足要求才能適用，才值得考慮其分離效價和其用於單次測試的成本。用於磁分離全自動化學發光免疫分析的鏈霉親和素磁珠：進口Dynal、JSR產品應用較多，Dynal分離效價接近JSR產品的兩倍，Bangs的產品磁響應速度較慢且非特異性吸附較高；截止2018年8月的國產鏈霉親和素磁珠中，僅重慶博藍鷹生物技術有限公司產品亞型MSP-SAV-Z1測試滿足鹼性磷酸酶和吖啶酯標記系統要求，且該亞型分離效價與Dynalbeads Myone Streptabvidin T1相當，但該公司另一亞型MSP-SAV-F1仍不能滿足化學發光免疫分析要求。用於基礎研究分離生物素修飾成分復合物時，進口和國產鏈霉親和素磁珠產品通常都能用。鏈霉親和素磁珠目前都以質量（mg或g）計量，但不同廠家產品單位質量對應分離效價差異大；針對相同測試/分離對象，以單次測試/分離的成本進行比較更合理，這也是多數廠家的報價依據。但考慮用於化學發光免疫分析的定性指標是否滿足要求，很多國產鏈霉親和素磁珠的報價就太高了。