人工誘變的物理方法

A. 關於生物基因誘導變種

人工誘變染色體加倍的方法：可分為物理誘變法、化學誘變法和生物誘變法。版
1、物理法包括：機械損傷、高低權溫和射線照射等
2、化學誘變。主要利用化學誘變劑與細胞發生一系列生化反應阻止有絲分裂的正常進行，使分裂後期的染色體全部進入一個子代細胞中而產生多倍體。化學葯劑包括秋水仙素、萘乙烷、異生長素、N-亞硝基-N-二甲脲、吲哚乙酸、氨磺靈、戊炔草胺、六氯化苯、三氯乙醛、氯化亞汞、富民隆等微管抑制劑。
3、生物學誘導途徑包括：不同倍性材料間雜交育種，胚乳培養，細胞雜交等

B. 何謂誘變育種

人為地利用物理、化學等因素誘導生物發生遺傳性的變異，依據育種目標選擇培育新品種的方法叫誘變育種。按照引起變異的因素不同，又可分為物理誘變和化學誘變兩種。

物理誘變是利用超聲波、高溫、激光、各種射線等物理因素誘導生物發生變異的方法，其中應用最廣的是輻射育種。

一、輻射育種

輻射育種是用放射線對植物種子、幼苗、花粉或營養體進行照射，使之發生遺傳性變異，經人工選擇培育新品種的方法。

輻射育種的射線，按其性質可分電磁波輻射和粒子輻射兩大類。前者常用的有X射線、γ射線和無線電微波等；後者，帶電的有α、β射線，不帶電的有中子。上述各種射線中，以中子射線的誘變率最高，β射線次之，γ射線和X射線更低。但由於射線來源、設備條件及安全等多種原因，目前最常用的還是γ射線。

輻射之所以能引起變異，是因為生物體受到電離輻射，其體內的分子或原子也直接或間接地發生電離和激發，生物組織中的化學鍵可發生斷裂，從而使分子結構或化學活性發生改變。有些射線如中子等還能和一些元素產生核反應，或者由於放射性元素的衰變而產生新的元素加入到有機體內改變了原有分子的組成。再者，生物細胞內的大量水分，在電離作用下，產生強烈的氧化還原反應，使新陳代謝發生變化，從而產生變異。

（一）葯用植物輻射育種的發展概況

自從1895年倫琴發現X射線，1896年貝克勒爾發現天然放射性物質以後，生物工作者開始用電離輻射對微生物、昆蟲和葯用植物進行研究。1921年Blakesles首先用射線照射曼陀羅（Datura stramonium L.）的種子，獲得了各種形態上的突變型。70年代以後Michalski用20kR劑量的γ射線照射毛花洋地黃（Digitalis lanata Ehrh.），獲得了毛花樣地黃有效成分含量高的品系。Parimoo用X射線處理羅芙木（Rauwolfia serpentina Benth.）的種子，所得突變體生物鹼含量特別高。Deril等用γ射線照射一葉萩（Securinega ramiflora Muell.-Arg.）的種子，選育出了高產的一葉萩突變品系。Getsadze用10—11kR的γ射線照射香羅勒（Ocimum gratissimum L.）的種子得到的突變體，不但具有高精油含量，而且具有抗尖鐮孢菌的能力。

我國的輻射育種開始於1957年，目前全國幾乎每個省、市、自治區都安裝了60Co-γ射線源，有的還安裝了137CS源、中子源和γ圃，為輻射育種提供了物質基礎，並取得了一定的成績。例如，用提純的紫皮阿城大蒜為材料，用60Co-γ射線照射，育成了阿輻4號大蒜新品種，其蒜頭平均鮮重是對照品種的2倍以上，不僅抗病耐貯，而且提前成熟8天。四川省中葯研究所用CO2激光照射薏苡種子，育成四激薏78—1號新品種，具有植株矮、分櫱多、千粒重大等優點。其它葯用植物如人參、元胡等的輻射育種工作已經開始。

（二）輻射的劑量單位和照射劑量

1.輻射的劑量單位

居里（Ci）

是表示放射性物質的放射強度單位，1Ci表示放射性同位素每秒鍾有3.7×1010次核衰變。

克鐳當量

是放射物放出的γ射線強度一定重量的鐳放出γ射線強度之比所得的放射強度單位。

倫琴（R）

是只用於X射線和γ射線的照射單位，它表示入射的輻射量。在1g空氣中能產生83Gy的射線能量即為1R。

拉特（rad）

是任何輻射都適用的單位。它表示被照射物吸收劑量的單位。任何1g被照射的物質吸收照射能100Gy時的劑量稱為1rad。

積分流量

即單位平方厘米的中子數（中子數/cm2）。中子的單位一般用它或用拉特來表示。

2.輻射的劑量

半致死照射劑量

即經過照射後植株成活率佔50%的照射量。

致死照射量

即經過照射後，引起植株全部死亡的照射量。

臨界照射量

即照射後植株成活率佔40%的照射量。一般採用臨界照射劑量作為輻射育種的適宜照射量。但也有用「半致死照射量」或更高照射量的。

照射劑量率

表示單位時間內的照射劑量。常用單位為R/h，R/min，R/s。

輻射育種的適宜照射劑量及劑量率隨不同植物而異，一般說來十字花科有較高的耐輻射能力，豆科耐輻射能力較低。同一物種中，多倍體比二倍體耐輻射，二倍體比單倍體耐輻射。植物的不同發育階段其耐輻射能力不同，分裂旺盛的細胞和組織對輻射比老化細胞和組織敏感。細胞核比細胞質敏感。

在一定的照射范圍內，突變數隨照射劑量的增加而增高，但是損傷效應也隨之提高，因此一定要選用適宜的照射劑量和劑量率，以便達到既有較高的突變率又有足夠的植株供選擇。例如中國醫學科學院葯用植物資源開發研究所1979—1982年在北京和吉林省集安縣國營一參場，經多次試驗摸索出用60Co-γ射線照射人參裂口種子，在50R/min劑量率下，照射劑量以1500—2000R為好。在此劑量下出苗率為對照的83.3%和37.5%，一年生幼苗的葉片幾乎都有不同程度的變異。正常情況為三小葉，照射後多變為一小葉、二小葉、長尾葉或很不規則的三小葉，有的葉面凸出，有的葉緣缺刻，有變異的植株占出苗株數的79%以上（表8—3）。試驗表明，高於10000R不出苗，低於500R葉片的變異率很低。

表8—3 人參種子用60Co-γ射線照射試驗

（三）輻射育種的基本方法

1.輻射材料的選擇輻射育種是在常規育種的基礎上發展起來的新技術，因此對材料的要求應該高些。輻射育種最適於改變一、二個不良性狀，只有選用綜合性狀優良、需要克服的缺點明確的材料，才能收到預期的效果。

2.輻射的處理方法

（1）外照射

用X射線、γ射線和中子照射植物的種子、花粉、子房及營養器官。

（2）內照射

其方法有多種。

①將82P、35S等放射性同位素配成適當比強的溶液浸泡種子或營養器官。

②將放射性同位素施放於土壤中，讓植物吸收。

③將放射性同位素溶液注射到植物的有關部位。

④供給植物帶14C的CO2，將14C同位素同化到代謝產物中去。

⑤將放射性同位素通過一定方式貼在植物的花芽或生長點上，使之產生芽變。

採用上述方法需要一定的防護設備，嚴防放射性物質的污染。處理過的材料不能食用或飼用。

3.輻射後代的選育

輻射育種的選擇方法和雜交育種大致相同，但由於輻射後代遺傳特性和雜種後代不完全一樣，因此後代的處理方法也有區別。

（1）輻射一代的處理

輻射後代一般用M表示，輻射的一、二、三代分別用M1、M2、M3表示；也可用射線名稱的第一個字母表示，如用X1、γ1、n1分別表示X、γ、中子照射的第一代。

由於M1代的性狀多呈隱性不能表現出來，因此一般不進行選擇。如果人力、物力不足，可一株留一至數粒種子，但供M2代選擇的個體一般情況下不能少於1000株。

（2）M2代的選擇

M2代是分離最大的一個世代，能遺傳的變異大多在M2代表現出來，因此M2代應大量選擇單株，淘汰不良的個體。

（3）M3代的選育

M3代仍有分離，但分離較小，因此M3代以選擇優良系統為主，在優良系統中可繼續選單株，供下一代繼續鑒定評選。

（4）M4代以後性狀基本穩定，以後的選育程序同常規育種。

（5）輻射營養器官的選育

無性繁殖的葯用植物，其遺傳基礎大多是異質結合的，輻射變異一經發生M1代就表現出來，因此M1代就要選擇，以後繼續無性繁殖不會發生分離。但是無性繁殖的器官如果發生了變異，細胞分裂較慢，生活力弱，生長發育不如正常細胞，為了給變異細胞創造生長發育的良好條件，可採用多次剪頂芽、剪側枝的辦法，促使變異莖部多長側枝，然後將其扦插或嫁接繁殖，以增加選擇的機會。

二、化學誘變育種

（一）發展概況

某些化學葯劑有誘導遺傳變異的作用，早在1910年就有過少量的研究。1911年麥克頓高爾（Mcdongl），1916年鮑爾（Baur），1936年薩哈洛夫（Sacharov）等人都發現化學物質能提高動植物的突變率，但在植物中一般認為利用化學物質誘發突變的工作應從約克斯（Oehlkers）1943年用烏來糖（Urethane脲烷）誘發月見草、百合及風鈴草染色體畸變的工作開始。

葯用植物上的化學誘變育種在70年代才發展起來。Kaul等用0.025%和0.05%的次乙亞胺處理顛茄種子所得的突變體植株高，分枝多，產量顯著提高，生物鹼含量提高47.3—72.7%。Kohgpatehko用0.05%的亞硝基乙基脲（NEU）處理歐茜草（Rubia tinctorum L.）的種子獲得了根中蒽醌衍生物的含量比對照組增加0.38%的品系。Arinshtein用亞硝基甲基脲（NMU）在歐丹參（Salvia sclarea L.）上誘發出早開花、遲開花、單位葉面積油腺多、抗病強等各類突變體。還獲得了適於機械化收獲的重衣草及高產精油的薔薇突變體。

（二）常用的葯用植物育種化學誘變劑

近年來化學誘變劑的發展很快，只要濃度適當，化學葯品誘發的突變率較高。加之化學葯品較各種射線源容易得到，且使用方便，故應用者較多。

目前在葯用植物育種中主要使用烷化劑，它們都有活躍的烷基，藉助於磷酸基、嘌呤基的烷化，與DNA或RNA起作用，引起基因的突變。例如，硫芥的產物能在DNA雙螺旋的兩條鏈之間形成「交聯」，阻止DNA雙鏈的分開，妨礙正常復制的進行而導致遺傳密碼的改良。常用的化學誘變劑有以下幾類：

1.芥子氣類，如氮芥類、硫芥類的許多化合物。

2.次乙亞胺（EI）、環氧乙烷。

3.烷基磺酸鹽類和烷基硫酸鹽類，如甲基磺酸乙烷（EMS）、乙基磺酸乙烷（EES）、硫酸二甲酯（DMS）、硫酸二乙酯（DES）、硫酸甲乙酯（MES）等。

4.亞硝基烷基化合物，如亞硝基甲基脲（NMU）、亞硝基乙基脲（NEU）等。

農作物上使用的種類尚有與核酸類似的鹼基化合物、簡單的無機化合物、各種麻醉劑、抗生素及某些中草葯中的高分子化合物如長春花鹼、石蒜鹼等。

（三）化學誘變的處理方法

植株的各部分都可用適當的方法進行處理，處理最多的是種子，其次是營養器官。植株的處理可將劈開一半的莖插入含有誘變溶液的管子內使它慢慢吸收，或者用棉團把誘變劑溶液引入植物體內，還可注射或塗抹在植物器官內外。當歸的同源四倍體就是選用儲存越冬中等大小的栽子，用刀片縱切栽子頂端中部3—5mm至頂端生長點，然後浸於0.01%富民農溶液中浸泡72小時誘導而成。

種子處理一般用浸泡法。葯劑濃度和浸泡時間對不同葯劑及不同處理對象來說是不同的，一般都要通過試驗找出最佳條件。

花粉的處理可在密閉系統內，把花粉鋪成單層用誘變劑蒸汽進行熏蒸。

使用化學誘變劑一定要小心謹慎，有些是致癌物，切忌接觸皮膚或吸入體內，並防止環境污染。

三、多倍體育種

多倍體育種是誘變育種中使細胞染色體加倍以後，再經選擇培育而成為新品種的方法。自從1937年有人首先利用秋水仙素處理曼陀羅一舉獲85%的四倍體以來，葯用植物的多倍體育種得到了蓬勃的發展。我國葯用植物資源豐富，多倍體育種具有廣闊的前景，目前已獲得牛膝和當歸的多倍體。

（一）多倍體的概念

各種生物的染色體數目是相對穩定的，任何植物的細胞染色體數與該物種的染色體基數（X）呈倍數性關系。一般植物體細胞的染色體數目為染色體基數的2倍，稱為「二倍體」；染色體數目為基數的3倍或3倍以上的稱為「多倍體」。配子細胞的染色體因減數分裂而減半，因此體細胞染色體數目是配子細胞染色體數目的2倍。通常用X表示物種的染色體基數，n表示配子細胞的染色體數。2n表示體細胞的染色體數。例如曼陀羅的染色體n=x=12，2n=2x=24。當歸的染色體n=x=11，2n=2x=22。染色體多倍化的現象廣泛存在於植物界，被子植物中有一半以上是多倍體。目前栽培的經濟作物大多數為多倍體。葯用植物的多倍體也不少，例如分布在北美的委陵菜屬中就存在這種以種的形式發生的多倍化系列，區域委陵菜（Potentilla finifima 2n=2x=14）是二倍體；賓洲委陵菜（P.pensylvanica 2n=4x=28）為四倍體；二回羽狀委陵菜（P.bripinnatifida 2n=8x=56）為八倍體。據觀察，我國葯用元胡的染色體也存在多倍化系列，全葉延胡（Corydalis repens Mandl.et Muchld.）、齒辦延胡索（C.turtschaninovii Bess.）為二倍體，2n=2x=16；延胡索（C.yanhusuo W.T.Wang）夏天無〔C.decumbens（Thunb）Pers.〕為四倍體，2n=4x=32；圓齒辦延胡索（C.remota var.rotundiloba Maxim.）為六倍體，2n=6x=48。

在多倍體中，根據染色體組的來源和性質分為同源多倍體和異源多倍體兩大類。

1.同源多倍體

染色體組的來源相同，並超過二個染色體組以上的多倍體稱為同源多倍體。正常二倍體細胞的染色體加倍以後就成為同源四倍體。同源四倍體和正常的二倍體雜交則可產生同源三倍體。三倍體植物因減數分裂時染色體混亂，不能配對，表現高度不育。

2.異源多倍體

染色體組來源不同，並超過二個染色體組以上的多倍體稱為異源多倍體。異源多倍體一般是由不同種屬間雜交所產生的雜種再通過染色體加倍而成。

多倍體和二倍體植物相比，在形態和生理上都有許多優點，一般具有較大的細胞和營養器官，抗病力較強，生物合成能力較高，因而有較高的有效成分含量。但並不是染色體增加的倍數越高越好，而是有一定的限度。一般認為三倍體和四倍體有最大的優勢。

（二）多倍體育種的應用方式

人們掌握了多倍體形成和控制其發生的規律以後，多倍體育種已成為培育良種的重要手段。目前主要有以下幾個方面的應用。

（1）通過遠緣雜交，對不孕雜種進行染色體加倍，克服遠緣雜種不育不孕性。我國小麥和黑麥雜交培育出世界著名的抗逆性強、產量和蛋白質含量都高的小黑麥新品種，就是一個典型的例子。葯用植物澳洲茄兩個變種雜交（Solanum aviculare var.albiflorum XS.aviculare var.brisbanense）也獲得人工異源多倍體。

（2）將二倍體葯用植物誘導成同源多倍體加以利用。例如鈴鹿等對曼陀羅（D.stramonium）的腋芽，用秋水仙素進行點滴處理，育成四倍體植株（2n=4x=48），其生葯葉重約為二倍體的1.7倍。光崗祐彥對含有消炎作用成分甘菊環的母菊（Matricaria thamomilla 2n=18）育成的四倍體（2n=36）花的大小和有效成分含量上均優於2倍體。由胡椒薄荷誘發出的多倍體（2n=144）品系不但精油含量高，而且抗旱、耐寒、抗病。

我國梁可均等用秋水仙鹼誘導的牛膝多倍體和二倍體相比，根肥大，木質化輕，產量高。

（3）利用三倍體的雜種優勢及無子性，三倍體植物具有明顯的雜種優勢，由於不孕而沒有種子。經濟作物甜菜和無籽西瓜是三倍體應用的典型例子。在葯用植物上，Trease等認為在罌粟的各倍性水平中，三倍體含嗎啡因的量最高。Jankulov報道毛曼陀羅的三倍體雜種平均生物鹼的得率超過二倍體的4倍，四倍體的3倍。

（三）人工誘導多倍體的方法和原則

1.常用葯品及使用方法

目前應用最普遍、效果好的多倍體誘變劑是0.05—0.2%的秋水仙素水溶液，其次是0.01—0.03%的富民隆水溶液。秋水仙易溶於水，毒性很大，少量葯液進入眼睛會導致失明，應特別小心。秋水仙素誘變的作用在於阻止細胞分裂中期紡錘絲的形成，染色體不能分配到兩個細胞中而形成多倍體。富民隆效果好，價格低，容易推廣，但不溶於水，使用時可稱取純的葯粉1g，倒入25ml丙酮中，放80℃水浴上加熱，搖動容器促使溶解，趁熱將已溶解的葯液倒入1000ml蒸餾水中，不斷攪拌即得0.1%富民隆原液，然後稀釋到需要的濃度使用。

處理方法一般採用浸漬法，也可用點滴、注射、塗抹、噴霧等方法。

2.人工誘變多倍體的原則

（1）誘變材料

同一類植物，染色體少的比染色體多的種類容易產生多倍體，而且所產生的多倍體在形態和生理上容易表現出優勢。已經是多倍體了，進一步多倍化有可能表現不良。因此，宜選擇染色體數較少的種類作誘變材料。

（2）處理時間

處理時間長短要根據不同葯用植物種類及所處狀態而定。處於休眠狀態的種子或種栽處理時間宜長，已發芽的種子或生長期的幼苗要適當縮短時間。由於植物的嫩芽或幼根對毒性和缺氧耐受力弱，可在葯液中浸泡一段時間（如12小時），在空氣中保濕一段時間（如12小時），如此共3—4天效果較好。

（3）處理溫度

以植物細胞分裂最適溫度下處理為好，如人參裂口種子以10℃左右為好，黃芪、枸杞等以20℃左右為好。在處理後的恢復時期以低溫、高濕為宜。

（四）多倍體的鑒定

多倍體的特點是植株、葉片、花器官、花粉粒等都較大，葉片較厚，表皮細胞單位面積內氣孔及葉綠體數與二倍體有區別，這些特徵都可作鑒別多倍體的依據，但最可靠的方法是觀察細胞的染色體數目。