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A. 包涵體純化蛋白復性案例分析——鍾鼎生物
使用IPTG誘導表達目的宴笑蛋白a。優化表達條件，將誘導條件調整至37℃，經分析目標蛋白主要呈包涵體形式。因此通過變復性的方式，重溶目標蛋白a，通過Ni柱親和純化獲得目的蛋白。
蛋白表達鑒定結果分析
IPTG誘導蛋白表達 ，經12% SDS-PAGE分析，目標蛋白主要存在於沉澱中，結果如圖所示
圖1 蛋白表達鑒定SDS-PAGE分析
Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression
M: 蛋白質分子質量標准
1: 未誘導
2: 誘導後
3: 誘導破碎後上清
4: 誘導破碎後沉澱
包涵體蛋白的變復性
1. 將菌體沉澱重懸於20 ml 裂解液 （20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0），超聲破碎（功率晌卜含400 W，工作4sec，間歇8sec，共20min）；
2. 將超聲破碎的細胞裂解液4℃ 10000 g離心20 min，收集沉澱；
3. 使用包涵體洗滌液（20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0）洗滌包涵體3次；
4. 用溶解緩沖液（20mM Tris，5mM DTT，8M尿素 pH8.0），按一定比例溶解包涵體，4℃放置過夜；室溫，15000 rpm離心15min；
5. 將上述溶液滴加20 mM Tris-HCl ，100 mM NaCl ，pH8.0緩沖液中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，將蛋白溶液裝入透析袋於20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH8.0溶液中透析過夜。
包涵體融合蛋白的Ni柱親和純化及結果分析
包涵體蛋白Ni柱純化
1. 利用低壓層析系統，包涵體溶液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱；
2. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；
3. 用Ni-IDA Washing-Buffer（20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0） 以1 ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；
4. 用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0） 以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；
5.上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH8.0進行透析過夜；
6. 進行12% SDS-PAGE分析, 結果如Fig.2所示。
純化結果分析
包涵體經過變復性的方式，重溶目標蛋白，通過Ni柱親和純化獲得目標蛋白，進行12% SDS-PAGE分析。
圖2 蛋白純化SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of fusion protein purification
M: 蛋白質分子質量標准
1: 破碎後處理樣品
2: 流出
3: 洗脫
Western Blot方法檢測包涵體復性
（1） 取樣品上樣5 μl
（弊粗2）上樣完畢後，聚丙烯醯胺凝膠先90 V跑完積層膠，再將電壓升至200 V直到電泳結束。
（3）電泳結束後，取下凝膠進行轉膜，恆壓100 V轉膜，約為1.5h，恆流250 mA
（4）電轉結束後，取下膜後先用PBST洗滌4次，每次5min。
（5）將膜置於5%脫脂奶粉封閉液中封閉37℃ 1h。
（6）用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中4℃過夜。
（7）次日將膜取出後用PBST 洗膜4次，每次5 min，
（8）用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37℃反應1h。
（9）反應完畢後，把膜取出後置於干凈的盒子中洗膜4次，每次5 min。
（10） ECL顯影，曝光。
Western Blot結果分析
一抗以及二抗稀釋比例：
編號抗體名稱稀釋比例二抗名稱稀釋比例
1His1：1000羊抗兔1：5000
圖3 蛋白Western Blot鑒定分析
Fig.3 Western Blot analysis of fusion protein purification
M: 蛋白質分子質量標准
1: 純化後樣品
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B. 南京鍾鼎生物科技倒閉了嗎
沒有。
根據企查查查詢可知，南京鍾鼎生物科技截止2023年4月14日還在正常運行中，並沒有倒閉。
南京鍾鼎生物科技成立於2011年2月17日，公司主要經營范圍包括生物技術及相關產品的研發、銷售、技術咨詢、技術服務等。
C. RT-PCR實驗案例解析—鍾鼎生物
鍾鼎生物技術公司基於與客戶合作的實際案例，介紹了RT-PCR的實驗流程，包括RT-PCR實驗所需試劑耗材、RNA提取、RNA反轉錄為cDNA。
實驗摘要
使用TRIzol提取樣品總RNA，反轉錄獲得cDNA，供下游實驗使用。
1.試劑與耗材
試劑與耗材
Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，寶生物工程（大連）有限公司，6210B；總RNA提取試劑TRIzol，南京鍾鼎生物技術有限公司，RK01-100；
DL2000 DNA Plus Marker（100、250、500、750、1000、1500、2000 bp），南京諾唯贊生物技術有限公司，MD101。GelStain，北京全式金生物技術有限公司，GS101-01；
DEPC，Sigma公司，D5758-25ML；Agarose，西班牙Biowest，91622；
離心管，美國Axygen，311-01-051；槍頭，美國Axygen；
其它試劑均為國產分析純。
2.主要實驗儀器
主要實驗儀器
超微量紫外分光光度計：NanoDrop2000，Thermo公司；台式高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司，Allegra 21R；
電子天平，美國AHOMS公司，AR5120；紫外透射儀，美國Amersham Pharmacia公司，Hofer MV-25；
電泳儀：TY2795型，BIO-RAD公司；電泳槽：Sub-Cell GT Cell，BIO-RAD公司；
凝膠成像分析系統：GelDocXR型，BIO-RAD公司；雪花狀製冰機，日本SANYO公司，SIM-F140AY65；
移液器，德國Eppendorf公司。
3.實驗方法及結果
3.1.RNA提取
（1）組織勻漿：向樣品中加入1 ml TRIzol試劑（組織塊體積不要超過TRIzol體積的10%），用移液器反復吹打。
（2）將上述勻漿液室溫放置5 min，待核酸和蛋白充分解離。每1 ml TRIzol試劑用量的勻漿液中加入0.2 ml氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈震搖15 s，然後室溫靜置2～3 min。
（3）4℃ 10,000 g，離心10 min。
（4）小心吸取上層水相（無色）加入到新試管中，同時計算所吸取的水相體積。
（5）加入所吸取水相等體積預冷的異丙醇，蓋緊管蓋，輕輕搖勻。
（6）室溫靜置10 min，待RNA充分沉澱。
（7）4℃ 10,000 g離心10 min。
（8）將上清棄除（注意別丟棄沉澱），每管加入1 ml 75%乙醇潤洗，蓋緊管蓋，輕輕晃動離心管，以去除殘留的異丙醇和鹽份。4℃ 7,500 g離心5 min。
（9）將上清棄除，打開管蓋，將RNA 沉澱乾燥（室溫揮發或真空乾燥）。注意RNA沉澱不可完全乾燥，否則難以溶解。
（10）將RNA沉澱溶解於適量的無RNase水中。
3.2.RNA瓊脂糖凝膠電泳分析
提取好的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖如下所示：
3.3.RNA濃度及純度測定
3.4.RNA反轉錄為cDNA
3.4.1.基因組DNA去除
採用鍾鼎公司的DNase I，在RNase free的離心管中配製如下混合液：
3.4.2.反轉錄反應
在PCR管中配製下列反應混合液：
65℃反應5 min，冰浴冷卻。
在第一步的反應管中配製下列反轉錄反應液：
反轉錄反應條件的設置：30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min。冰浴冷卻。產物至於-20℃冰箱保存。
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