人工诱变的物理方法

A. 关于生物基因诱导变种

人工诱变染色体加倍的方法：可分为物理诱变法、化学诱变法和生物诱变法。版
1、物理法包括：机械损伤、高低权温和射线照射等
2、化学诱变。主要利用化学诱变剂与细胞发生一系列生化反应阻止有丝分裂的正常进行，使分裂后期的染色体全部进入一个子代细胞中而产生多倍体。化学药剂包括秋水仙素、萘乙烷、异生长素、N-亚硝基-N-二甲脲、吲哚乙酸、氨磺灵、戊炔草胺、六氯化苯、三氯乙醛、氯化亚汞、富民隆等微管抑制剂。
3、生物学诱导途径包括：不同倍性材料间杂交育种，胚乳培养，细胞杂交等

B. 何谓诱变育种

人为地利用物理、化学等因素诱导生物发生遗传性的变异，依据育种目标选择培育新品种的方法叫诱变育种。按照引起变异的因素不同，又可分为物理诱变和化学诱变两种。

物理诱变是利用超声波、高温、激光、各种射线等物理因素诱导生物发生变异的方法，其中应用最广的是辐射育种。

一、辐射育种

辐射育种是用放射线对植物种子、幼苗、花粉或营养体进行照射，使之发生遗传性变异，经人工选择培育新品种的方法。

辐射育种的射线，按其性质可分电磁波辐射和粒子辐射两大类。前者常用的有X射线、γ射线和无线电微波等；后者，带电的有α、β射线，不带电的有中子。上述各种射线中，以中子射线的诱变率最高，β射线次之，γ射线和X射线更低。但由于射线来源、设备条件及安全等多种原因，目前最常用的还是γ射线。

辐射之所以能引起变异，是因为生物体受到电离辐射，其体内的分子或原子也直接或间接地发生电离和激发，生物组织中的化学键可发生断裂，从而使分子结构或化学活性发生改变。有些射线如中子等还能和一些元素产生核反应，或者由于放射性元素的衰变而产生新的元素加入到有机体内改变了原有分子的组成。再者，生物细胞内的大量水分，在电离作用下，产生强烈的氧化还原反应，使新陈代谢发生变化，从而产生变异。

（一）药用植物辐射育种的发展概况

自从1895年伦琴发现X射线，1896年贝克勒尔发现天然放射性物质以后，生物工作者开始用电离辐射对微生物、昆虫和药用植物进行研究。1921年Blakesles首先用射线照射曼陀罗（Datura stramonium L.）的种子，获得了各种形态上的突变型。70年代以后Michalski用20kR剂量的γ射线照射毛花洋地黄（Digitalis lanata Ehrh.），获得了毛花样地黄有效成分含量高的品系。Parimoo用X射线处理罗芙木（Rauwolfia serpentina Benth.）的种子，所得突变体生物碱含量特别高。Deril等用γ射线照射一叶萩（Securinega ramiflora Muell.-Arg.）的种子，选育出了高产的一叶萩突变品系。Getsadze用10—11kR的γ射线照射香罗勒（Ocimum gratissimum L.）的种子得到的突变体，不但具有高精油含量，而且具有抗尖镰孢菌的能力。

我国的辐射育种开始于1957年，目前全国几乎每个省、市、自治区都安装了60Co-γ射线源，有的还安装了137CS源、中子源和γ圃，为辐射育种提供了物质基础，并取得了一定的成绩。例如，用提纯的紫皮阿城大蒜为材料，用60Co-γ射线照射，育成了阿辐4号大蒜新品种，其蒜头平均鲜重是对照品种的2倍以上，不仅抗病耐贮，而且提前成熟8天。四川省中药研究所用CO2激光照射薏苡种子，育成四激薏78—1号新品种，具有植株矮、分蘖多、千粒重大等优点。其它药用植物如人参、元胡等的辐射育种工作已经开始。

（二）辐射的剂量单位和照射剂量

1.辐射的剂量单位

居里（Ci）

是表示放射性物质的放射强度单位，1Ci表示放射性同位素每秒钟有3.7×1010次核衰变。

克镭当量

是放射物放出的γ射线强度一定重量的镭放出γ射线强度之比所得的放射强度单位。

伦琴（R）

是只用于X射线和γ射线的照射单位，它表示入射的辐射量。在1g空气中能产生83Gy的射线能量即为1R。

拉特（rad）

是任何辐射都适用的单位。它表示被照射物吸收剂量的单位。任何1g被照射的物质吸收照射能100Gy时的剂量称为1rad。

积分流量

即单位平方厘米的中子数（中子数/cm2）。中子的单位一般用它或用拉特来表示。

2.辐射的剂量

半致死照射剂量

即经过照射后植株成活率占50%的照射量。

致死照射量

即经过照射后，引起植株全部死亡的照射量。

临界照射量

即照射后植株成活率占40%的照射量。一般采用临界照射剂量作为辐射育种的适宜照射量。但也有用“半致死照射量”或更高照射量的。

照射剂量率

表示单位时间内的照射剂量。常用单位为R/h，R/min，R/s。

辐射育种的适宜照射剂量及剂量率随不同植物而异，一般说来十字花科有较高的耐辐射能力，豆科耐辐射能力较低。同一物种中，多倍体比二倍体耐辐射，二倍体比单倍体耐辐射。植物的不同发育阶段其耐辐射能力不同，分裂旺盛的细胞和组织对辐射比老化细胞和组织敏感。细胞核比细胞质敏感。

在一定的照射范围内，突变量随照射剂量的增加而增高，但是损伤效应也随之提高，因此一定要选用适宜的照射剂量和剂量率，以便达到既有较高的突变率又有足够的植株供选择。例如中国医学科学院药用植物资源开发研究所1979—1982年在北京和吉林省集安县国营一参场，经多次试验摸索出用60Co-γ射线照射人参裂口种子，在50R/min剂量率下，照射剂量以1500—2000R为好。在此剂量下出苗率为对照的83.3%和37.5%，一年生幼苗的叶片几乎都有不同程度的变异。正常情况为三小叶，照射后多变为一小叶、二小叶、长尾叶或很不规则的三小叶，有的叶面凸出，有的叶缘缺刻，有变异的植株占出苗株数的79%以上（表8—3）。试验表明，高于10000R不出苗，低于500R叶片的变异率很低。

表8—3 人参种子用60Co-γ射线照射试验

（三）辐射育种的基本方法

1.辐射材料的选择辐射育种是在常规育种的基础上发展起来的新技术，因此对材料的要求应该高些。辐射育种最适于改变一、二个不良性状，只有选用综合性状优良、需要克服的缺点明确的材料，才能收到预期的效果。

2.辐射的处理方法

（1）外照射

用X射线、γ射线和中子照射植物的种子、花粉、子房及营养器官。

（2）内照射

其方法有多种。

①将82P、35S等放射性同位素配成适当比强的溶液浸泡种子或营养器官。

②将放射性同位素施放于土壤中，让植物吸收。

③将放射性同位素溶液注射到植物的有关部位。

④供给植物带14C的CO2，将14C同位素同化到代谢产物中去。

⑤将放射性同位素通过一定方式贴在植物的花芽或生长点上，使之产生芽变。

采用上述方法需要一定的防护设备，严防放射性物质的污染。处理过的材料不能食用或饲用。

3.辐射后代的选育

辐射育种的选择方法和杂交育种大致相同，但由于辐射后代遗传特性和杂种后代不完全一样，因此后代的处理方法也有区别。

（1）辐射一代的处理

辐射后代一般用M表示，辐射的一、二、三代分别用M1、M2、M3表示；也可用射线名称的第一个字母表示，如用X1、γ1、n1分别表示X、γ、中子照射的第一代。

由于M1代的性状多呈隐性不能表现出来，因此一般不进行选择。如果人力、物力不足，可一株留一至数粒种子，但供M2代选择的个体一般情况下不能少于1000株。

（2）M2代的选择

M2代是分离最大的一个世代，能遗传的变异大多在M2代表现出来，因此M2代应大量选择单株，淘汰不良的个体。

（3）M3代的选育

M3代仍有分离，但分离较小，因此M3代以选择优良系统为主，在优良系统中可继续选单株，供下一代继续鉴定评选。

（4）M4代以后性状基本稳定，以后的选育程序同常规育种。

（5）辐射营养器官的选育

无性繁殖的药用植物，其遗传基础大多是异质结合的，辐射变异一经发生M1代就表现出来，因此M1代就要选择，以后继续无性繁殖不会发生分离。但是无性繁殖的器官如果发生了变异，细胞分裂较慢，生活力弱，生长发育不如正常细胞，为了给变异细胞创造生长发育的良好条件，可采用多次剪顶芽、剪侧枝的办法，促使变异茎部多长侧枝，然后将其扦插或嫁接繁殖，以增加选择的机会。

二、化学诱变育种

（一）发展概况

某些化学药剂有诱导遗传变异的作用，早在1910年就有过少量的研究。1911年麦克顿高尔（Mcdongl），1916年鲍尔（Baur），1936年萨哈洛夫（Sacharov）等人都发现化学物质能提高动植物的突变率，但在植物中一般认为利用化学物质诱发突变的工作应从约克斯（Oehlkers）1943年用乌来糖（Urethane脲烷）诱发月见草、百合及风铃草染色体畸变的工作开始。

药用植物上的化学诱变育种在70年代才发展起来。Kaul等用0.025%和0.05%的次乙亚胺处理颠茄种子所得的突变体植株高，分枝多，产量显著提高，生物碱含量提高47.3—72.7%。Kohgpatehko用0.05%的亚硝基乙基脲（NEU）处理欧茜草（Rubia tinctorum L.）的种子获得了根中蒽醌衍生物的含量比对照组增加0.38%的品系。Arinshtein用亚硝基甲基脲（NMU）在欧丹参（Salvia sclarea L.）上诱发出早开花、迟开花、单位叶面积油腺多、抗病强等各类突变体。还获得了适于机械化收获的重衣草及高产精油的蔷薇突变体。

（二）常用的药用植物育种化学诱变剂

近年来化学诱变剂的发展很快，只要浓度适当，化学药品诱发的突变率较高。加之化学药品较各种射线源容易得到，且使用方便，故应用者较多。

目前在药用植物育种中主要使用烷化剂，它们都有活跃的烷基，借助于磷酸基、嘌呤基的烷化，与DNA或RNA起作用，引起基因的突变。例如，硫芥的产物能在DNA双螺旋的两条链之间形成“交联”，阻止DNA双链的分开，妨碍正常复制的进行而导致遗传密码的改良。常用的化学诱变剂有以下几类：

1.芥子气类，如氮芥类、硫芥类的许多化合物。

2.次乙亚胺（EI）、环氧乙烷。

3.烷基磺酸盐类和烷基硫酸盐类，如甲基磺酸乙烷（EMS）、乙基磺酸乙烷（EES）、硫酸二甲酯（DMS）、硫酸二乙酯（DES）、硫酸甲乙酯（MES）等。

4.亚硝基烷基化合物，如亚硝基甲基脲（NMU）、亚硝基乙基脲（NEU）等。

农作物上使用的种类尚有与核酸类似的碱基化合物、简单的无机化合物、各种麻醉剂、抗生素及某些中草药中的高分子化合物如长春花碱、石蒜碱等。

（三）化学诱变的处理方法

植株的各部分都可用适当的方法进行处理，处理最多的是种子，其次是营养器官。植株的处理可将劈开一半的茎插入含有诱变溶液的管子内使它慢慢吸收，或者用棉团把诱变剂溶液引入植物体内，还可注射或涂抹在植物器官内外。当归的同源四倍体就是选用储存越冬中等大小的栽子，用刀片纵切栽子顶端中部3—5mm至顶端生长点，然后浸于0.01%富民农溶液中浸泡72小时诱导而成。

种子处理一般用浸泡法。药剂浓度和浸泡时间对不同药剂及不同处理对象来说是不同的，一般都要通过试验找出最佳条件。

花粉的处理可在密闭系统内，把花粉铺成单层用诱变剂蒸汽进行熏蒸。

使用化学诱变剂一定要小心谨慎，有些是致癌物，切忌接触皮肤或吸入体内，并防止环境污染。

三、多倍体育种

多倍体育种是诱变育种中使细胞染色体加倍以后，再经选择培育而成为新品种的方法。自从1937年有人首先利用秋水仙素处理曼陀罗一举获85%的四倍体以来，药用植物的多倍体育种得到了蓬勃的发展。我国药用植物资源丰富，多倍体育种具有广阔的前景，目前已获得牛膝和当归的多倍体。

（一）多倍体的概念

各种生物的染色体数目是相对稳定的，任何植物的细胞染色体数与该物种的染色体基数（X）呈倍数性关系。一般植物体细胞的染色体数目为染色体基数的2倍，称为“二倍体”；染色体数目为基数的3倍或3倍以上的称为“多倍体”。配子细胞的染色体因减数分裂而减半，因此体细胞染色体数目是配子细胞染色体数目的2倍。通常用X表示物种的染色体基数，n表示配子细胞的染色体数。2n表示体细胞的染色体数。例如曼陀罗的染色体n=x=12，2n=2x=24。当归的染色体n=x=11，2n=2x=22。染色体多倍化的现象广泛存在于植物界，被子植物中有一半以上是多倍体。目前栽培的经济作物大多数为多倍体。药用植物的多倍体也不少，例如分布在北美的委陵菜属中就存在这种以种的形式发生的多倍化系列，区域委陵菜（Potentilla finifima 2n=2x=14）是二倍体；宾洲委陵菜（P.pensylvanica 2n=4x=28）为四倍体；二回羽状委陵菜（P.bripinnatifida 2n=8x=56）为八倍体。据观察，我国药用元胡的染色体也存在多倍化系列，全叶延胡（Corydalis repens Mandl.et Muchld.）、齿办延胡索（C.turtschaninovii Bess.）为二倍体，2n=2x=16；延胡索（C.yanhusuo W.T.Wang）夏天无〔C.decumbens（Thunb）Pers.〕为四倍体，2n=4x=32；圆齿办延胡索（C.remota var.rotundiloba Maxim.）为六倍体，2n=6x=48。

在多倍体中，根据染色体组的来源和性质分为同源多倍体和异源多倍体两大类。

1.同源多倍体

染色体组的来源相同，并超过二个染色体组以上的多倍体称为同源多倍体。正常二倍体细胞的染色体加倍以后就成为同源四倍体。同源四倍体和正常的二倍体杂交则可产生同源三倍体。三倍体植物因减数分裂时染色体混乱，不能配对，表现高度不育。

2.异源多倍体

染色体组来源不同，并超过二个染色体组以上的多倍体称为异源多倍体。异源多倍体一般是由不同种属间杂交所产生的杂种再通过染色体加倍而成。

多倍体和二倍体植物相比，在形态和生理上都有许多优点，一般具有较大的细胞和营养器官，抗病力较强，生物合成能力较高，因而有较高的有效成分含量。但并不是染色体增加的倍数越高越好，而是有一定的限度。一般认为三倍体和四倍体有最大的优势。

（二）多倍体育种的应用方式

人们掌握了多倍体形成和控制其发生的规律以后，多倍体育种已成为培育良种的重要手段。目前主要有以下几个方面的应用。

（1）通过远缘杂交，对不孕杂种进行染色体加倍，克服远缘杂种不育不孕性。我国小麦和黑麦杂交培育出世界著名的抗逆性强、产量和蛋白质含量都高的小黑麦新品种，就是一个典型的例子。药用植物澳洲茄两个变种杂交（Solanum aviculare var.albiflorum XS.aviculare var.brisbanense）也获得人工异源多倍体。

（2）将二倍体药用植物诱导成同源多倍体加以利用。例如铃鹿等对曼陀罗（D.stramonium）的腋芽，用秋水仙素进行点滴处理，育成四倍体植株（2n=4x=48），其生药叶重约为二倍体的1.7倍。光岗祐彦对含有消炎作用成分甘菊环的母菊（Matricaria thamomilla 2n=18）育成的四倍体（2n=36）花的大小和有效成分含量上均优于2倍体。由胡椒薄荷诱发出的多倍体（2n=144）品系不但精油含量高，而且抗旱、耐寒、抗病。

我国梁可均等用秋水仙碱诱导的牛膝多倍体和二倍体相比，根肥大，木质化轻，产量高。

（3）利用三倍体的杂种优势及无子性，三倍体植物具有明显的杂种优势，由于不孕而没有种子。经济作物甜菜和无籽西瓜是三倍体应用的典型例子。在药用植物上，Trease等认为在罂粟的各倍性水平中，三倍体含吗啡因的量最高。Jankulov报道毛曼陀罗的三倍体杂种平均生物碱的得率超过二倍体的4倍，四倍体的3倍。

（三）人工诱导多倍体的方法和原则

1.常用药品及使用方法

目前应用最普遍、效果好的多倍体诱变剂是0.05—0.2%的秋水仙素水溶液，其次是0.01—0.03%的富民隆水溶液。秋水仙易溶于水，毒性很大，少量药液进入眼睛会导致失明，应特别小心。秋水仙素诱变的作用在于阻止细胞分裂中期纺锤丝的形成，染色体不能分配到两个细胞中而形成多倍体。富民隆效果好，价格低，容易推广，但不溶于水，使用时可称取纯的药粉1g，倒入25ml丙酮中，放80℃水浴上加热，摇动容器促使溶解，趁热将已溶解的药液倒入1000ml蒸馏水中，不断搅拌即得0.1%富民隆原液，然后稀释到需要的浓度使用。

处理方法一般采用浸渍法，也可用点滴、注射、涂抹、喷雾等方法。

2.人工诱变多倍体的原则

（1）诱变材料

同一类植物，染色体少的比染色体多的种类容易产生多倍体，而且所产生的多倍体在形态和生理上容易表现出优势。已经是多倍体了，进一步多倍化有可能表现不良。因此，宜选择染色体数较少的种类作诱变材料。

（2）处理时间

处理时间长短要根据不同药用植物种类及所处状态而定。处于休眠状态的种子或种栽处理时间宜长，已发芽的种子或生长期的幼苗要适当缩短时间。由于植物的嫩芽或幼根对毒性和缺氧耐受力弱，可在药液中浸泡一段时间（如12小时），在空气中保湿一段时间（如12小时），如此共3—4天效果较好。

（3）处理温度

以植物细胞分裂最适温度下处理为好，如人参裂口种子以10℃左右为好，黄芪、枸杞等以20℃左右为好。在处理后的恢复时期以低温、高湿为宜。

（四）多倍体的鉴定

多倍体的特点是植株、叶片、花器官、花粉粒等都较大，叶片较厚，表皮细胞单位面积内气孔及叶绿体数与二倍体有区别，这些特征都可作鉴别多倍体的依据，但最可靠的方法是观察细胞的染色体数目。