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A. 包涵体纯化蛋白复性案例分析——钟鼎生物
使用IPTG诱导表达目的宴笑蛋白a。优化表达条件，将诱导条件调整至37℃，经分析目标蛋白主要呈包涵体形式。因此通过变复性的方式，重溶目标蛋白a，通过Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。
蛋白表达鉴定结果分析
IPTG诱导蛋白表达 ，经12% SDS-PAGE分析，目标蛋白主要存在于沉淀中，结果如图所示
图1 蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析
Fig.1 SDS-PAGE analysis of expression
M: 蛋白质分子质量标准
1: 未诱导
2: 诱导后
3: 诱导破碎后上清
4: 诱导破碎后沉淀
包涵体蛋白的变复性
1. 将菌体沉淀重悬于20 ml 裂解液 （20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail, pH 8.0），超声破碎（功率晌卜含400 W，工作4sec，间歇8sec，共20min）；
2. 将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000 g离心20 min，收集沉淀；
3. 使用包涵体洗涤液（20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0）洗涤包涵体3次；
4. 用溶解缓冲液（20mM Tris，5mM DTT，8M尿素 pH8.0），按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，15000 rpm离心15min；
5. 将上述溶液滴加20 mM Tris-HCl ，100 mM NaCl ，pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris-HCl，100 mM NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。
包涵体融合蛋白的Ni柱亲和纯化及结果分析
包涵体蛋白Ni柱纯化
1. 利用低压层析系统，包涵体溶液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱；
2. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
3. 用Ni-IDA Washing-Buffer（20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0） 以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
4. 用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0） 以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；
5.上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH8.0进行透析过夜；
6. 进行12% SDS-PAGE分析, 结果如Fig.2所示。
纯化结果分析
包涵体经过变复性的方式，重溶目标蛋白，通过Ni柱亲和纯化获得目标蛋白，进行12% SDS-PAGE分析。
图2 蛋白纯化SDS-PAGE分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of fusion protein purification
M: 蛋白质分子质量标准
1: 破碎后处理样品
2: 流出
3: 洗脱
Western Blot方法检测包涵体复性
（1） 取样品上样5 μl
（弊粗2）上样完毕后，聚丙烯酰胺凝胶先90 V跑完积层胶，再将电压升至200 V直到电泳结束。
（3）电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100 V转膜，约为1.5h，恒流250 mA
（4）电转结束后，取下膜后先用PBST洗涤4次，每次5min。
（5）将膜置于5%脱脂奶粉封闭液中封闭37℃ 1h。
（6）用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀释液中4℃过夜。
（7）次日将膜取出后用PBST 洗膜4次，每次5 min，
（8）用含5%牛奶的封闭液稀释二抗。膜在二抗中37℃反应1h。
（9）反应完毕后，把膜取出后置于干净的盒子中洗膜4次，每次5 min。
（10） ECL显影，曝光。
Western Blot结果分析
一抗以及二抗稀释比例：
编号抗体名称稀释比例二抗名称稀释比例
1His1：1000羊抗兔1：5000
图3 蛋白Western Blot鉴定分析
Fig.3 Western Blot analysis of fusion protein purification
M: 蛋白质分子质量标准
1: 纯化后样品
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B. 南京钟鼎生物科技倒闭了吗
没有。
根据企查查查询可知，南京钟鼎生物科技截止2023年4月14日还在正常运行中，并没有倒闭。
南京钟鼎生物科技成立于2011年2月17日，公司主要经营范围包括生物技术及相关产品的研发、销售、技术咨询、技术服务等。
C. RT-PCR实验案例解析—钟鼎生物
钟鼎生物技术公司基于与客户合作的实际案例，介绍了RT-PCR的实验流程，包括RT-PCR实验所需试剂耗材、RNA提取、RNA反转录为cDNA。
实验摘要
使用TRIzol提取样品总RNA，反转录获得cDNA，供下游实验使用。
1.试剂与耗材
试剂与耗材
Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，宝生物工程（大连）有限公司，6210B；总RNA提取试剂TRIzol，南京钟鼎生物技术有限公司，RK01-100；
DL2000 DNA Plus Marker（100、250、500、750、1000、1500、2000 bp），南京诺唯赞生物技术有限公司，MD101。GelStain，北京全式金生物技术有限公司，GS101-01；
DEPC，Sigma公司，D5758-25ML；Agarose，西班牙Biowest，91622；
离心管，美国Axygen，311-01-051；枪头，美国Axygen；
其它试剂均为国产分析纯。
2.主要实验仪器
主要实验仪器
超微量紫外分光光度计：NanoDrop2000，Thermo公司；台式高速冷冻离心机，美国BECKMAN公司，Allegra 21R；
电子天平，美国AHOMS公司，AR5120；紫外透射仪，美国Amersham Pharmacia公司，Hofer MV-25；
电泳仪：TY2795型，BIO-RAD公司；电泳槽：Sub-Cell GT Cell，BIO-RAD公司；
凝胶成像分析系统：GelDocXR型，BIO-RAD公司；雪花状制冰机，日本SANYO公司，SIM-F140AY65；
移液器，德国Eppendorf公司。
3.实验方法及结果
3.1.RNA提取
（1）组织匀浆：向样品中加入1 ml TRIzol试剂（组织块体积不要超过TRIzol体积的10%），用移液器反复吹打。
（2）将上述匀浆液室温放置5 min，待核酸和蛋白充分解离。每1 ml TRIzol试剂用量的匀浆液中加入0.2 ml氯仿，盖紧管盖，手动剧烈震摇15 s，然后室温静置2～3 min。
（3）4℃ 10,000 g，离心10 min。
（4）小心吸取上层水相（无色）加入到新试管中，同时计算所吸取的水相体积。
（5）加入所吸取水相等体积预冷的异丙醇，盖紧管盖，轻轻摇匀。
（6）室温静置10 min，待RNA充分沉淀。
（7）4℃ 10,000 g离心10 min。
（8）将上清弃除（注意别丢弃沉淀），每管加入1 ml 75%乙醇润洗，盖紧管盖，轻轻晃动离心管，以去除残留的异丙醇和盐份。4℃ 7,500 g离心5 min。
（9）将上清弃除，打开管盖，将RNA 沉淀干燥（室温挥发或真空干燥）。注意RNA沉淀不可完全干燥，否则难以溶解。
（10）将RNA沉淀溶解于适量的无RNase水中。
3.2.RNA琼脂糖凝胶电泳分析
提取好的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图如下所示：
3.3.RNA浓度及纯度测定
3.4.RNA反转录为cDNA
3.4.1.基因组DNA去除
采用钟鼎公司的DNase I，在RNase free的离心管中配制如下混合液：
3.4.2.反转录反应
在PCR管中配制下列反应混合液：
65℃反应5 min，冰浴冷却。
在第一步的反应管中配制下列反转录反应液：
反转录反应条件的设置：30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min。冰浴冷却。产物至于-20℃冰箱保存。
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